شناسایی و بیان نوترکیب ایزوفرم ژنی سنتز کننده کروسین در کلاله زعفران

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسنده

دانشگاه محقق اردبیلی

10.22048/jsat.2019.133922.1302

چکیده

وجود ایزوفرم‌های ژنی مختلف در گیاهان منجر به ایجاد ایزومرهای مختلف از متابولیت‌ها به مانند متابولیت‌های گلیکوزیله شده می‌گردند. در تحقیق حاضر به شناسایی و بیان هترولوگ ایزوفرم ژنی کد کننده آنزیم گلیکوزیل ترانسفراز کلاله گیاه زعفران در مرحله گرده افشانی پرداخته شد. نتایج حاصل از توالی‌یابی و آنالیز‌های بیوانفورماتیکی توالی ژنی جدا شده از ژنوم گیاه زعفران با استفاده از آغازگرهای هرزگرد نشان داد که این توالی ژنی با اندازه 1368 جفت باز متعلق به خانواده پروتئینی گلیگوزیل ترانسفرازها بوده که بصورت آپو‌پلاستی در سلول ترشح می‌گردد. جهت بررسی عملکرد آنزیمی، ابتدا توالی کامل ژنی ایزوله شده با تکنیک Gibson Assembly در وکتور بیانی pThio-UGT تحت پروموتر القایی آرابینوز، ساب‌کلون شده و با روش الکتروپوراسیون در سویه باکتریایی BL21-pGro که بیان کننده پروتئین‌های چاپرونی با زیرواحدهای ELو ES بود ترارریخت گردید. پروتئین‌های بیانی به دنبال تخریب دیواره باکتری با روش فراصوت و سوسپانسیون سازی رسوب باکتری در محلول PBS، به روش جوشانیدن استخراج شد. نهایتا جداسازی پروتئین‌های نوترکیب با بارگذاری روی ژل 10%SDS-PAGE نشان داد که حاصل بیان هترولوگ ایزوفرم ژنی آنزیم گلیکوزیل ترانسفراز پروتئینی با وزن مولکولیkDa 69/5 می‌باشد. نتایج حاصل از این پروژه می‌تواند در تعیین استراتژی‌های اصلاح نژادی برای بهبود صفات کیفی و کمی مانند رنگ و عطر در گیاه زعفران بکار گرفته شوند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Identification and recombinant expression of Crocin synthesis isoform gene in Saffron stigma

چکیده [English]

The existence of isoform genes in plants led to the creation of the different types of isomeric metabolites like these glycosylated forms. This study was conducted to investigate the identification and heterologous expression of Saffron stigmas Glycosyl transferase coding isoform gene during the pollination stage. The results have been obtained by sequencing and bioinformatics analysis of an isolated gene from saffron genomes by degenerate oligo’s revealed that the gene is in1283 bp length and belongs to CsUGT protein family which has Apo- plastic secretion in the cell. to evaluate the enzymatic function, firstly the isolated sequence was sub-cloned under arabinose induce promoter in pThio-UGT expression vector by Gibson assembly technique, then the recombinant vector transformed into BL21-pGro7 bacteria which were able to express chaperon proteins with EL& ES subunits. Followed by destructing the bacteria cell wall via ultrasound, the pellet was suspended by PBS solution and then the soluble proteins were extracted by boiling method. Finally, the protein electrophoresis by SDS pages10% was showed that the recombinant protein of CsUGT expressed correctly in bacteria with 69/5 kDa molecular weight. The gained results in this project could be applied to determine the breeding's strategies to improve qualitative and quantitative traits such as color and aroma in saffron.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Recombinant expression
  • Glycosyl transferase
  • Crocin
  • E. coli